Плавится ли ДНК?

Допустим, вы хотите создать точную копию интересующей вас ДНК. Для этого пришлось бы сначала разделить две нити двойной спирали, а затем создать нуклеотидные цепочки, комплементарные каждой из них. Фактически именно это и происходит при каждом делении клеток, когда специальные белки «расстегивают» двухцепочечную ДНК. Однако за пределами клеток мы можем применять другой подход, который позволяет нам реплицировать (размножать копированием) любые участки ДНК по нашему желанию: ничтожное количество ДНК мы преобразуем в бесчисленное множество идентичных копий, чтобы генетического материала хватило для проведения анализов или переноса в новые объекты. Крошечные количества нуклеотидных цепей можно, например, добыть на месте преступления, чтобы оценить их сходство с ДНК подозреваемых; или выделить из амниотической жидкости, чтобы проверить, нет ли у развивающегося плода генетических аномалий либо инфекций, которые можно выявить по нуклеиновым кислотам возбудителей; или извлечь из опухоли, чтобы картировать в геноме мутации, указывающие на развитие рака; или, наконец, отобрать из организма нобелевского лауреата, чтобы реплицировать и по частям внедрить в бактерии, которые разрастутся в настоящий арт-объект. Искусственная репликация ДНК, как и естественная, требует разделения двойной спирали, а его, в свою очередь, обеспечивает такое физическое явление, как фазовый переход4.

Представьте, что нас интересует, как разделить не нити двойной спирали ДНК, а прочно связанные молекулы воды, из которых состоит кубик льда. Мы знаем ответ: лед надо нагреть. При температуре выше 0 °C лед расплавляется в жидкую воду, где каждая молекула пребывает в движении, лишь мимолетно связываясь с другими молекулами. Как правило, температура выступает злейшим врагом притяжения и порядка, и эта тема постоянно всплывает в физике. В случае с водой переход из твердого состояния в жидкое происходит резко, как только достигается температура плавления, равная 0 °C при нормальном атмосферном давлении. Даже если температура хотя бы на пару градусов ниже нуля, вода пребывает в твердом состоянии, если же на пару градусов выше – в жидком. Не у всех веществ, однако, этот переход столь же резок. Мед при нагревании не становится текучим только в момент достижения определенной температуры, а теряет вязкость постепенно.

Как мы помним, связи между нитями двойной спирали ДНК слабее, чем внутри нити. Это позволяет нам предположить, что можно разделять нуклеотидные цепочки нагреванием, не уничтожая их. И так оно и есть, но насколько постепенно происходит это преобразование? Иными словами, плавится ли ДНК? Ответ на этот вопрос важен, если мы хотим разделять нити для дальнейшей репликации. Если ДНК плавится (денатурирует в узком диапазоне температур, резко), то превышением температуры фазового перехода даже на несколько градусов мы точно добьемся полного разделения цепей (см. верхнюю половину рисунка). Если же ДНК не свойственен такой фазовый переход, то, скорее всего, часть молекулы останется неразделенной и ее невозможно будет скопировать (см. нижнюю половину рисунка).

Во втором случае мы можем продолжать нагрев до тех пор, пока не разделятся все фрагменты ДНК, но, вероятно, на практике это потребует таких высоких температур, что сама ДНК и любые другие биологические молекулы окажутся поврежденными.

Как выясняется, цепи ДНК разделяются резко, то есть молекула действительно плавится. Если взять пробирку с ДНК и нагреть ее, молекулы останутся двухнитевыми до достижения определенной температуры плавления, а сразу после ее превышения распадутся на отдельные нити. Мы не просто можем измерить это в лаборатории, но и понимаем, почему так происходит. Выяснение природы фазовых переходов – переходов между твердым, жидким и газообразным состояниями, или между магнитной и немагнитной формами, или между любыми другими альтернативными структурами материалов – стало одним из величайших триумфов физики XX века. Плавление ДНК – это переход от порядка к беспорядку, в целом типичный для всех переходов, но имеющий свои особенности.

Все фазовые переходы отражают конфликт порядка и беспорядка. В основе порядка, как правило, лежит энергия, связанная с притяжением или выравниванием, а беспорядок определяется геометрией – тем, какими способами компоненты могут располагаться в пространстве. Повышение температуры многократно усиливает позиции беспорядка. При низкой температуре побеждает стремление к порядку, при высокой беспорядок берет верх. Так, в холоде молекулы воды выстраиваются в кристаллическую решетку льда, а когда теплеет, их положение в пространстве характеризуется типичной для жидкости хаотичностью. Утверждение, что плавление представляет собой резкий переход от одного состояния к другому, означает существование специфической температуры, разделяющей их, то есть четкой границы между фазами порядка и беспорядка.

Энергия упорядочения и разновидности беспорядка зависят от того, какие измерения может осваивать вещество. Последствия фазовых переходов драматичны, и в общем случае теория не предсказывает резкого перехода одномерных материалов из одной фазы в другую. Так, цепочка из молекул воды не должна расплавиться вдруг в какой-то точке температурной кривой: беспорядок возникнет уже при самой низкой из возможных температур и будет неуклонно усиливаться с ее повышением.

С приличной долей приближения можно сказать, что протяженная двухцепочечная ДНК одномерна – как идущие одна за другой ступеньки на приставной лестнице. Следовательно, ее резкое плавление, наблюдаемое в лаборатории, вроде бы противоречит ожиданиям. Однако, когда нити расцепляются, высвобожденная одноцепочечная ДНК изгибается и скручивается в трех измерениях (см. рисунок) под действием случайных сил, влияющих на все молекулы, которые мы обсудим в этой книге. Хотя движения нитей случайны, их последствия стабильны и предсказуемы (с подобным мы не раз еще столкнемся): благодаря конечной конфигурационной свободе полное их разделение происходит при фиксированной температуре перехода, как это свойственно трехмерным материалам. Располагая экспериментальными данными и теоретическим обоснованием, мы можем даже спрогнозировать температуру, при которой разделится та или иная молекула ДНК. Обычно температура перехода составляет около 95 °C, что чуть ниже температуры кипения воды, но точное значение сильно зависит от нуклеотидной последовательности.

Итак, мы можем разделить нити ДНК в пробирке, просто нагрев ее. Если мы хотим реплицировать эту ДНК, далее необходимо построить комплементарные последовательности к каждой из нитей. Для этого мы можем позаимствовать у природы инструмент, рутинно применяемый нашими клетками, – фермент ДНК-полимеразу. Однако при температуре плавления ДНК обычные белки превратятся в бесполезную резиноподобную массу наподобие вареного яичного белка (который в сухом остатке и состоит главным образом из белка). Биологам пришлось найти хитрый способ этого избежать: мы применяем ДНК-полимеразы из бактерий, живущих в горячих источниках, поскольку белки этих организмов в ходе эволюции приспособились исправно работать при высокой температуре. При этом важно, что для начала репликации нити ДНК любой полимеразе необходим хотя бы небольшой двухнитевой участок молекулы (см. рисунок ниже). Бактериологи обнаружили и очистили термостабильную полимеразу в 1976 году, и к началу 1980-х все ингредиенты оказались в сборе. В 1983 году рецепт, в котором сочетаются нуклеотиды, полимеразы, молекулы ДНК и температура, пришел в голову ученому Кэри Муллису, когда он ночью ехал вдоль Берегового хребта Калифорнии5. Вместе с рецептом пришло и осознание, что так открывается дорога к простой и почти безграничной репликации ДНК. Сегодня этот процесс называется полимеразной цепной реакцией, или ПЦР^[9].

Чтобы провести ПЦР, первым делом мы вносим в деионизованную воду со специальным солевым раствором (буфером) все ингредиенты: небольшое количество ДНК, которую мы хотим реплицировать^[10]; ДНК-полимеразу; отдельные нуклеотиды (A, Ц, Г и T) в большом количестве и праймеры – в достаточном. Праймеры, или затравки, представляют собой короткие одноцепочечные фрагменты ДНК (обычно не длиннее 30 нуклеотидов), комплементарные концам копируемого участка ДНК. Мелкие детальки, разбросанные по рисункам, – это праймеры (они подлиннее) и нуклеотиды (они покороче).

Далее мы повышаем температуру примерно до 95 °C, чтобы расплавить ДНК и из исходной двойной спирали получить две отдельные нити.

После этого мы понижаем температуру, чтобы праймеры связались с соответствующими концами однонитевых ДНК. Праймеров много, поэтому матричная однонитевая ДНК с гораздо большей вероятностью наткнется на праймер, чем на свою бывшую партнерскую нить: предсказуемая случайность работает на нас. Далее полимераза «садится» на ДНК-матрицу и наращивает конец праймера подходящими нуклеотидами, звено за звеном синтезируя комплементарную нить. После завершения процесса мы получаем две двойных спирали ДНК, созданные по шаблону одной исходной.

Затем мы повторяем цикл нагревания, охлаждения и синтеза, что дает нам уже 4 молекулы ДНК; в последующих циклах мы получим 8, 16, 32, 64… Соответственно, 10 удвоений даст нам 1024 молекулы, 20 – миллион, 30 (что вполне позволяют автоматизированные приборы для ПЦР – амплификаторы, или термоциклеры) – более миллиарда!^[11]

Следовательно, ничтожное количество ДНК мы можем превращать во множество идентичных молекул, тем самым как бы усиливая шепот до громкого хора реплик, который можно на любой вкус применять в медицинской диагностике, терапии и криминалистике. В живых организмах копирование ДНК происходит только в качестве элемента замысловатого репродуктивного танца, порождающего совершенно новую клетку или даже организм. Полимеразная цепная реакция позволяет копировать ДНК по нашему желанию. Рецепт ее прекрасен в своей простоте. Сам Муллис писал, что, узнав о его изобретении, молекулярные биологи «чуть ли не всегда первым делом произносили: `И почему же я до этого не додумался?'«Муллис отвечал на это так: «И никто на самом деле не знает почему; я уж точно не знаю. Однажды ночью эта мысль просто врезалась мне в голову».

Приручив репликацию ДНК, мы можем создавать достаточное количество копий для секвенирования генома – установления точного порядка нуклеотидов в нем с помощью техник, которые мы опишем в части III. Этот подход позволил нам картировать геномы человека и многих других организмов.

Поскольку для ПЦР нужны праймеры, которые создают необходимый для полимеразы короткий двухнитевой участок ДНК и прикрепляются только к комплементарной им нуклеотидной последовательности, у вас может возникнуть вопрос, не должны ли мы тогда заранее знать, какую последовательность амплифицируем. Нет, это не обязательно. Прежде всего для каких-то целей достаточно знать лишь часть генома организма, с ДНК которого мы работаем, и тогда можно конструировать праймеры, прикрепляющиеся именно к этой части. В большинстве же случаев мы можем нарезать неизвестную ДНК на фрагменты и встроить их в хорошо знакомую нам ДНК, например в специальные элементы генома легко выращиваемых бактерий^[12]. Для этого мы используем встречающиеся в природе белки, которые сшивают нити ДНК. В таком варианте праймеры, комплементарные известной ДНК, направят ДНК-полимеразу на неизвестные части. Именно так «прочитали», например, выделенный из древних останков геном шерстистого мамонта, вымершего несколько тысяч лет назад.